中华草龟的抗肿瘤活性肽的分离纯化及鉴定研究（我们可爱的中华草龟崛起啦~）

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中华草龟肉抗肿瘤活性肽的分离纯化及鉴定研究

摘要：该研究选取中华草龟肉为原料，以其木瓜蛋白酶酶解所得多肽对人乳腺癌细胞 MCF-7 增殖的抑制功效为活性检测指标，采用 MTT 细胞毒性实验对具有抗癌作用的多肽组分进行追踪测定。先采用截留分子量 10 ku 的超滤膜对酶解液进行截留，再通过 Sephadex G-75、G-50 及 LH-60 等层析技术手段对截留所得活性成分进行分离纯化。RP-HPLC 谱图的结果表明，最终分离纯化出了一个纯度较高的抗癌活性组分 TP-1，其 IC50 值约为 2.7 mg/mL，呈明显的抗癌剂量依赖性与时间依赖性，且对正常细胞毒性极小。随后通过紫外、红外、圆二色谱对 TP-1 进行理化性质表征，并采用质谱技术对该多肽主成分分子量进行鉴定。结果表明 TP-1 中含有 β 折叠，β 转角和无规则卷曲结构，且主成分多肽分子量约为 1410.7 u，本研究成果为进一步开展中华草龟活性肽的抗癌机理研究奠定了坚实基础。

 

关键词：中华草龟；抗肿瘤；抗癌；生物活性肽；分离；纯化

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众所周知，在世界范围内，癌症（“恶性肿瘤”）已成为首要死因之一，约占所有死亡人数的 1/8，并显著影响人口的变化[1]。尽管近年来化疗药物在治疗癌症方面取得了较大进展，但依旧存在很多问题。据澳洲一项统计数据显示[2]，治疗性和辅助性细胞毒性化疗对成人 5 年生存率的总体贡献在澳大利亚为2.3%，在美国仅为 2.1%。

因此，根据一些新型作用机制研发新型高效抗癌药物将成为当前的研究热点，而生物活性肽（Biologically active peptides，BAP）抗癌活性尤为突出，且在很大程度上优于传统的化疗药物，对于解决传统化疗药物的弊端具有重要的意义[3]。生物活性肽本身是一类由母蛋白通过酶水解、肠道消化或食品加工而释放出来的具有生理和激素调节作用的多功能肽[4]。研究表明，通过酶解蛋白获得的生物活性肽具有抗菌、抗氧化、抗增殖和抗诱变等活性，正是这些活性使得其具有抗癌潜能[5]。随着研究手段和方法的不断提高以及蛋白质工程和酶工程技术的迅速发展，特别是免疫活性肽与抗癌活性肽研究的不断深入，未来生物活性肽的开发和利用将具有广阔的前景

中华草龟（Chinemys reevesiis）又名乌龟，草龟，泥龟等，属龟鳖目（Testudinate）龟科（Emydidae）乌龟属（Chinemys），生活在淡水水域，分布于全国各地。中华草龟既是一种美味可口和营养价值高的珍贵佳肴，又是一种具有重要医疗价值的药物[7]。传统中医认为，中华草龟对癌症具有辅助治疗效果[8]，但这一效果至今尚未得到科学证实，有待进一步研究。

近年来，国内对龟类抗肿瘤的研究一直处于匍匐前行状态，目前仅有从金钱龟（Cuora trifasciata）中提取抗肿瘤肽的报道[9]，因此从中华草龟中提取抗肿瘤活性肽对龟类在抗癌领域的发展具有重要意义。

 

在前期的研究中，我们利用单因素和正交试验法获得了酶法提取中华草龟抗肿瘤粗提肽的最佳条件[10]。本文进一步采用分离纯化和活性检测相结合的方法对该粗提肽的有效成分进行筛选，最终得到组分较单一的抗癌活性肽。该研究可为抗癌先导药物的研发以及中华草龟的深加工提供理论基础。

 

1 材料与方法 

1.1 实验材料

中华草龟龟肉的抗肿瘤活性肽酶解产物冻干粉，自制[10]。制作方法：称取一定量的龟肉，匀浆后用木瓜蛋白酶酶解，酶解时间 8 h，pH 7.5，温度 60 ℃，加酶量 0.5%（4000 U/g），料液比 3:1。酶解结束后沸水浴灭酶 6 min，冷却后过滤，滤液在 8000 r/min 的转速下离心 15 min，取上清液冷冻干燥成粉末备用。

 

1.2 主要试剂

 

胎牛血清（优级纯），美国 Hyclone 公司； RPMI-1640 培养基，美国 Hyclone 公司；DMEM 培养基，美国 Hyclone 公司；胰蛋白酶，美国 Sigma 公司；青霉素-链霉素，美国 Gibco 公司；MTT，美国 Sigma 公司；DMSO，美国 Sigma 公司；细胞培养瓶，美国 Costar 公司；96 孔细胞培养板，美国 Costar 公司；Sephadex G-75、Sephadex G-50、Sephadex LH-60，北京拜尔迪生物技术有限公司；TRIS，北京索莱宝科技有限公司；一级色谱纯乙腈，四友精细化学品有限公司；三氟乙酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他试剂均为分析纯（AR）。

 

1.3 癌（肿瘤）细胞株

人乳腺癌 MCF-7 细胞株和小鼠成纤维细胞 L929，均购自中科院上海生化细胞所。

 

1.4 仪器与设备

 

LDZX-30KBS 高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂；CKX41 倒置显微镜，日本 Olympus 公司；Varioscan Flash 酶标仪，美国 Bio-Rad 公司；VTGD1312 细胞培养箱，美国 Shell Lab 公司；ZHJH-C1112C 型超净工作台，上海博通化学科技有限公司；FD-1B-50 冷冻干燥机，北京博医康仪器有限公司；CT15RT 冷冻离心机，上海天美；8400 超滤杯/10000 u 超滤膜，美国 Millipore 公司；YC-2 层析实验冷柜，北京博医康实验仪器有限公司；Φ 3.2×75 cm 层析柱，上海琪特分析仪器有限公司；CBS-C 多功能全自动部分收集器，上海沪西；BT-200B 数显恒流泵，上海沪西；Φ 4.6×250am Symmetry C18 反相色谱柱，美国 Waters 公司；2695 高效液相色谱仪，美国 Waters 公司；Nicolet 67 傅里叶红外光谱仪，美国 Thermo Nicolet 公司；J-810圆二色光谱仪，日本 Jasco 公司；液相色谱-飞行时间质谱仪，美国 Waters 公司；L-8900 氨基酸全自动分析仪，日本 HITACHI 公司。

 

1.5 实验方法与内容

  1.5.1 细胞毒性检测

 

制备 MCF-7 细胞悬液，以 1×104 个/mL 接种于 96 孔细胞培养板，每孔 180 μL，置 5% CO2、37 ℃贴壁培养 24 h；随后加入相应浓度的中华草龟抗癌成分（同时设立 PBS 对照组）继续培养 24 h；加入 5% MTT 20 μL，再继续培养 4 h；吸弃培养液，加入 150 μL DMSO 充分振荡 10 min；最后置酶标仪上，在波长 570 nm 处测定吸光度 A 值，按公式计算细胞增殖抑制率，即IR%=(OD 对照组-OD 实验组)/OD 对照×100%[10]。

 

  1.5.2 酶解液超滤分级

 

本实验采用截留分子量为 10 ku 的超滤膜进行超滤。在常温下，以氮气（N2）为加压气体，设定 0.2 MPa （表压）压力进行操作，分离后收集对应组分的滤液，冷冻干燥后通过细胞毒性检测实验（即 MTT 法）分别测定其对癌细胞的生长抑制率。

 

  1.5.3 氨基酸总含量检测

 

根据细胞毒性检测实验结果，超滤组分在 10 ku 以下部分有较高的细胞毒性，所以选择龟肉、龟肉酶解液和 10 ku 以下超滤组分的冻干样品进行氨基酸组成及对应各种氨基酸含量百分比的检测分析，并进行相互比较。具体操作方法为：精确称取样品 0.01 g，溶于蒸馏水，并定容至 100 mL；取 1 mL 置安瓿瓶中，加2 mL 6 mol/L HCl（色氨酸 Trp 未测定）后充满氮气，在酒精喷灯下快速密封，并放入 110 ℃烘箱中水解 24 h；水解完全冷却后，在 70 ℃水浴锅中挥发盐酸，双蒸水洗涤 2~3 次，并蒸干；用适量 pH 2.20 的缓冲液溶解。定容；最后用 0.22 μm 微孔滤膜过滤后上机检测[11]

 1.5.4 葡聚糖凝胶柱层析

 

采用 Sephadex G-75，Sephadex G-50 和 Sephadex LH-60 柱对龟肉酶解液进行分离纯化。Sephadex G-75和 Sephadex G-50 柱的条件是：采用蒸馏水进行洗脱，流速 0.8 mL/min，上样量为 10 mL（约含 500 mg 蛋白样品）；Sephadex LH-60 柱的条件是：洗脱液为甲醇/水混合溶液，并采用梯度洗脱（甲醇含量从 10%逐渐升高至 100%冲柱）。自动收集器每管收集时间 4 min，收集体积 3.2 mL，检测波长 280 nm，自动收集器配置Collection version 2.5 版本的核酸蛋白检测系统软件，收集数据后进行蛋白图谱分析。1.5.5 反相高效液相色谱采用 Symmetry Shield RP C18 5 μm 柱，洗脱液 A为 100%双蒸水（含 0.1% TFA），洗脱液 B 为 100%乙腈(含 0.1%TFA)，洗脱条件为：0~5 min，0% B；5~20 min，30% B；20~30 min，70% B；30~35 min，0% B。

 洗脱液流速：2 mL/min。检测波长 215 nm，柱温 30 ℃。样品上样量为 50 €€L，上样前用 0.22 μm 微孔滤膜过滤[12]。

 

 1.5.6 紫外扫描吸收图谱

 

将纯化以后的多肽组分配制成浓度为 0.10 mg/mL 样品，用酶标仪在 200~380 nm 波长扫描紫外吸收波谱。

 

 1.5.7 红外图谱

 

对经初步分离纯化得到的多肽组分，与一定量的 KBr 混合后置于玛瑙研钵内研磨成细微粉末，装样手动压片，用傅里叶变换红外扫描仪在 4000~400 cm-1 范围内进行扫描。

 

 1.5.8 圆二色图谱

 

多肽样品配制成 0.20 mg/mL 溶液，取 450 €€L 溶液将光径为 1 mm 的比色皿充满，设定扫描速率 100 nm/min，扫描 180~280 nm 的圆二色谱图。

 1.5.9 主成分多肽分子量测定

 

对 TP-1 组分中的主成分多肽进行分子量测定。经 UPLC 分析后的样品流穿过电喷雾界面进入质谱仪，雾化气和干燥气均为高纯氮气，采用正离子扫描模式，在质/核比（m/z）350~1800 范围内进行扫描[13]，最终获得主成分多肽分子量。

 1.5.10 活性肽 IC50 值

经过 Sephadex LH-60 纯化得到三个多肽组分，分别对其进行乳腺癌 MCF-7 癌细胞的毒性检测实验，同时考察活性肽对正常小鼠成纤维细胞 L929 的毒性作用，最后计算活性最好组分峰Ⅰ的 IC50 值及其对时间（选择浓度 1 mg/mL）和浓度的依赖性。

1.5.11 数据处理与统计方法

 

数据处理采用 Microsoft Excel 2007，图表的绘制采用 Excel 2007 以及 OriginPro 8.5。

 

2 结果与讨论

 

2.1 氨基酸检测结果及分析

 

通常情况下，小肽类分子的氨基酸组成及一定量的螺旋或折叠直接决定了活性肽的生理功能，如抗氧化活性肽和 ACE 抑制活性肽等[14]。在这些小肽分子中，少数几个氨基酸出现的几率要远高于其余的氨基酸。

由表 1 可知，中华草龟龟肉经酶解、超滤，并冻干后，大部分氨基酸占总氨基酸比例呈现出较大的变化。但总体上来说，具备以下特点：亮氨酸（Leu）、甘氨酸（Gly）、赖氨酸（Lys）、丙氨酸（Ala）、异亮氨酸（Ile）、缬氨酸（Val）、胱氨酸（Cys）等七种氨基酸含量远高于其余氨基酸，氮端（N-）氨基酸序列中，甘氨酸（Gly）、亮氨酸（Leu）、赖氨酸（Lys）、丙氨酸（Ala）、胱氨酸（Cys）出现频率较高，碳端（C-）序列中，赖氨酸（Lys）、亮氨酸（Leu）、丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）、胱氨酸（Cys）、缬氨酸（Val）出现频率较高，该结果符合 Tyagi [15]报道的抑癌抑菌活性多肽的特点。那些对抗肿瘤活性肽的生物活性有重要影响的氨基酸种类（标★），其含量百分比均位于前列，这在一定程度上提示了龟肉蛋白有潜在的抗肿瘤作用。此外，三种样品中的谷氨酸含量均为最高，且通过酶解及超滤处理可使样品中的疏水性氨基酸比例趋于增加。根据 Chalamaiah 等的研究结论[16]，抗癌肽的疏水性氨基酸含量一般较高，而且带电氨基酸（如谷氨酸）对活性肽抗癌性质的形成有重要作用，其含量通常也较高。由此可见，酶解和超滤处理对后续抗癌肽的获得和筛选具有重要的意义。

2.2  柱层析纯化结果

    

根据抗癌活性检测结果，超滤组分在 10 ku 以下

的部分有较高的细胞毒活性，因此选择分子量小于 10ku 的组分进一步进行分离纯化，依次采用 G-75 葡聚糖层析、G-50葡聚糖层析、羟丙基葡聚糖凝胶Sephadex LH-60 层析筛选抗癌较单一组分，分离过程中采用细胞毒性实验对抗癌组分进行追踪。

本研究根据多肽分子大小和极性对样品进行分离 命名为峰 A 和峰 B；细胞毒性检测结果显示峰 A 对纯化。在多肽的分离纯化过程中，采用多种技术联用，不仅可以扬长避短，优势互补，节约时间，而且可提高分离的效果和精确度[17]。 由图 1 可知，酶解液 10 ku以下组分经过 Sephadex G-75 柱图谱分离得到两个峰，命名为峰 A和峰B；细胞毒性检测结果显示峰 A 对 MCF-7 抑制率较高Sephadex G-50 柱， MCF-7 抑制率较高（53.57%），所以选择峰 A 组分过Sephadex G-50 柱,又分离出两个峰，命名为峰 a 和峰b,细胞毒性检测结果显示峰 b 对 MCF-7 抑制率较高（55.26%），因此选择峰 b 组分过 Sephadex LH-60 柱，进行梯度洗脱，最终分离得到三个峰，依次命名为峰Ⅰ、峰Ⅱ和峰Ⅲ，且各峰区分程度明显，分离效果良好；细胞毒性追踪结果显示峰Ⅰ、峰Ⅱ和峰Ⅲ组分对正常小鼠成纤维细胞 L929 的毒性均较小，但对乳腺癌细胞 MCF-7 的毒性均较大，其中峰Ⅰ显示出了最强的细胞毒性，其最大抑制率（IR%）可达 80%以上，将该组分命名为 TP-1（tortoise peptide-1）。从细胞毒性实验结果可以看出，随着不同分离纯化步骤的依次进行，所得活性组分的抑癌效果逐渐增强，表明酶解粗提物中的抗癌活性组分得到了充分提取，同时也表明本研究所选的分离纯化手段是科学可行的。

 

2.3 活性组分紫外、红外、圆二色谱表征 

TP-1 组分进行紫外吸收全波长扫描、红外扫描和圆二色谱表征，其结果分别见图 2、3 和 4 所示。

由图 2 可知，该组分在 220~280 nm 表现出肽键的强吸收，表明产物中存在芳香族氨基酸，这也是典型的蛋白质和多肽的特征吸收[18]。

 

由图 3 可知，在 1650~1230 cm-1 处的吸收峰为酰胺键的特征吸收，3276~3400 cm-1 处的吸收峰可能是O-H 和 N-H 的伸缩振动，673 cm-1 和 1061 cm-1 可能是 -NH2 的吸收，在 2986 cm-1 处的吸收可能是-CH3 的伸缩振动，而酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅲ带通常是由 α-螺旋、β

折叠、转角和无规则卷曲的叠加共同作用所产生的吸收带，蛋白分子氨基酸之间含有大量肽键，且由于羰基键的伸缩振动，导致了酰胺Ⅰ带的特征吸收峰通常位于 1600~1700 cm-1 处[19]。图中 1650 cm-1 附近处有C=O 伸缩振动（酰胺Ⅰ），此振动可形成无规则卷曲；多肽结构中酰胺Ⅲ带的特征吸收通常位于 1340~1220 cm-1，图中 1241 cm-1、1230 cm-1 处的吸收表明，该多肽结构中的酰胺Ⅲ带有 β 折叠的存在。红外图谱结果为精确分析多肽结构提供了一定的参考价值，结合后续的质谱技术可基本确定多肽化学结构[20,21]。

Greenfield[22]在利用圆二色谱对蛋白质和多肽二级结构预测中总结出了不同二级结构（α-螺旋、β 折叠、转角和无规则卷曲）所对应的典型特征吸收谱图，β-转角在 180~190 nm 范围内会呈现负峰，无规则卷曲一般会在 200 nm 呈明显负峰，结合图 4 及 Greenfield 的结论，提示了 TP-1 组分中 β-转角及无规卷曲构象结构含量较高[23]，该结果和前面红外光谱分析得出的无规则卷曲结论相吻合。综合考虑，该活性肽可能同时存在 β-转角，β 折叠和无规则卷曲，然而正是这些二级结构共同决定了该多肽组分的生物活性[24]。

2.4 RP-HPLC 图谱

RP-HPLC 分析结果如图 5 所示，在保留时间约为10 min 时得到 TP-1 组分的主要多肽成分，其含量明显高于其他多肽含量，且由图 5 也可以看出，该组分中杂质成分极少，纯度较高。

 

2.5 质谱法对主成分多肽分子量测定

收集 TP-1 组分，采用 UPLC 串联 NSI 喷雾质谱仪进行分子量测定。质谱仪自动对来自 UPLC 的洗脱组分交替进行一级质谱（MS）和二级质谱（MS/MS）处理，借助分析软件和蛋白数据库，可对各组分进行分子量测定[25]。质谱结果如图 6 所示，结果显示 MH+为 1411.7 u，经计算得出该组分（TP-1）中主成分多肽分子量约为 1410.7 u，其属于低分子量短肽。通常，低分子量肽易于消化吸收且具备较多生理功能，如抗癌作用[16]。目前，从水生生物中已提取出来少量抗癌肽，如 Hsu 等[26]从金枪鱼的暗色肌中提取出了分子量分别为 1206 u 和 1124 u 的两种短肽，其对人乳腺癌细胞 MCF-7 具有较强的抑制作用；Sheih 等[27]从藻类中提取出了分子量为 1309 u 的短肽，其对人胃癌细胞 AGS 有较强的抑制作用。以上抗癌肽均属低分子量短肽，且与本文主成分多肽分子量相近。此外，结合本文前面的氨基酸分析结果，所得多肽极具抗癌肽的特征，该结论为细胞毒性实验结果提供了一定的理论依据。

2.6 细胞毒性及 IC50 值

对 TP-1 进行细胞毒性试验，以其对乳腺癌细胞 MCF-7 生长抑制率作为指标，进行剂量依耐性与时间依耐性检测，所得结果如图 7、8。

由图 7 和图 8 可知，TP-1 组分具有明显的药物浓度依赖性和时间梯度依赖性。以 95%为置信度，对浓度依赖性曲线进行线性回归得到其线性关系方程为

y=4.1195x+39.03369，R2=0.96832>0.707，拟合度较好。计算 IC50 值约为 2.7 mg/mL。由于该组分对正常细胞的毒性均较小，符合药物先导物要求[28]，有一定开发潜力。

3 结论

 

氨基酸含量的分析表明，中华草龟龟肉及其酶解物中含有丰富的活性氨基酸，这些氨基酸是抗肿瘤活性肽所必需的氨基酸，且经过连续葡聚糖凝胶柱层析后，最终得到一个活性较强的组分 TP-1，其 IC50 值约为 2.7 mg/mL，且对正常细胞毒性极小。RP-HPLC 谱图的结果表明，该组分纯度较高。最后经 LC-MS/MS 分析测得 TP-1 组分中主成分多肽分子量约为 1410.7 u，该多肽成分的研究为后续进一步结合生物技术或生物工程手段进行抗癌先导药物合成奠定了基础。

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